一、前期準(zhǔn)備

1. 實驗環(huán)境準(zhǔn)備：對細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行清潔消毒，開啟超凈工作臺紫外燈照射30分鐘以上，照射結(jié)束后關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)15-20分鐘。同時檢查培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等設(shè)備，確保其參數(shù)正常（如培養(yǎng)箱溫度37℃、CO?濃度5%）。

2. 試劑與耗材準(zhǔn)備：提前將培養(yǎng)基、血清、胰酶、PBS緩沖液等試劑從冰箱取出，置于室溫下平衡至室溫（或按試劑要求進(jìn)行預(yù)熱）。培養(yǎng)瓶、離心管、移液管等耗材需經(jīng)滅菌處理，確認(rèn)無破損、污染后備用。

3. 個人防護(hù)：實驗人員穿戴無菌實驗服、手套、口罩，規(guī)范進(jìn)行手部消毒，避免人為污染。

二、細(xì)胞復(fù)蘇（若使用凍存細(xì)胞）

1. 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中，快速搖晃使管內(nèi)凍存液在1-2分鐘內(nèi)全部融化。

2. 融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有預(yù)熱培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻，以1000-1200rpm的速度離心5-8分鐘。

3. 離心結(jié)束后，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使其分散成單細(xì)胞懸液。

4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞貼壁及生長情況。

三、細(xì)胞傳代

1. 觀察細(xì)胞：通過倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時，即可進(jìn)行傳代。

2. 清洗細(xì)胞：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，加入適量PBS緩沖液，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，清洗細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基及血清，隨后棄去PBS緩沖液，重復(fù)清洗1-2次。

3. 消化細(xì)胞：向培養(yǎng)瓶中加入適量胰酶消化液，確保消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-3分鐘，期間可通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙增大時，立即加入適量含血清的培養(yǎng)基終止消化。

4. 吹打分散：用移液管輕輕吹打培養(yǎng)瓶壁上的細(xì)胞，使細(xì)胞全部脫落并分散成單細(xì)胞懸液，避免用力吹打?qū)е录?xì)胞損傷。

5. 離心分裝：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000-1200rpm離心5-8分鐘，棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。根據(jù)實驗需求，將細(xì)胞懸液分裝至新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)基后搖勻，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

四、細(xì)胞換液

1. 當(dāng)培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色（pH值下降）或細(xì)胞生長至一定階段時，需進(jìn)行換液。

2. 打開超凈工作臺，取出培養(yǎng)瓶，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，使舊培養(yǎng)基匯集在一側(cè)，用移液管緩慢吸棄舊培養(yǎng)基。

3. 加入適量PBS緩沖液清洗細(xì)胞1次，棄去PBS后，加入預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基，搖勻后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

五、細(xì)胞收集與處理（根據(jù)實驗需求）

1. 若需收集細(xì)胞，按細(xì)胞傳代步驟進(jìn)行消化、終止消化及離心，獲得細(xì)胞沉淀。

2. 對細(xì)胞沉淀進(jìn)行后續(xù)處理，如加入細(xì)胞裂解液提取蛋白、加入固定液進(jìn)行染色觀察，或用于其他實驗操作。

六、實驗后整理

1. 及時清理超凈工作臺，將使用過的耗材分類處理（如污染耗材進(jìn)行滅菌后丟棄，可重復(fù)使用耗材按規(guī)定清洗滅菌）。

2. 關(guān)閉實驗設(shè)備，記錄細(xì)胞培養(yǎng)情況（如細(xì)胞種類、代數(shù)、生長狀態(tài)、操作內(nèi)容等），確保實驗數(shù)據(jù)完整可追溯。

3. 再次清潔培養(yǎng)室環(huán)境，保持實驗區(qū)域整潔，為后續(xù)實驗提供無菌條件。